产品货号:
KM0173
中文名称:
钙离子荧光探针(Fura-8,AM) ,超级纯
英文名称:
Fluo-8, Acetoxymethyl Ester
产品规格:
50μg|5×50μg
发货周期:
1~3天
产品价格:
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Fluo-8,是目前最亮的可见光激发波长Ca2+荧光探针,其荧光强度比Fluo-4强两倍,比Fluo-3强四倍。Fluo-8具中等程度的Ca2+亲和力,几乎接近Fluo-3,Fluo-4(Fluo-3:Kd=0.4μM、Fluo-4:Kd=0.36μM、Fluo-4:Kd= 0.389μM),使用上几乎同Fluo-3和Fluo-4。
Fluo-8不仅维持Fluo-3,Fluo-4便捷的光谱检测特性,与Ca2+结合后的最大激发波长为490nm,最大发射波长为514nm。而且具有改善的细胞载入和Ca2+响应能力。Fluo-8加载具较弱的温度依赖性,在室温或37℃孵育皆染色良好,不像Fluo-3,Fluo-4严格要求在37℃孵育,此特征使其更适用于HTS高通量筛选实验。Fluo-8应用广泛,与许多细胞系和靶向样本兼容,不会受配体或靶标本身信号干扰。Fluo-8可通过激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光显微镜等来检测胞内钙离子水平的变化。
Fluo-8,AM是Fluo-8的一种乙酰甲酯衍生物,具有细胞膜渗透性,只需简单培养,即可轻易进入细胞。一旦进入细胞内,即被其内酯酶剪切生成不具膜渗透性的Fluo-8,从而滞留在胞内以发挥相应生理功能。本品以50μg小包装的冻干粉形式供货,用于细胞内Ca2+水平检测时,常用浓度为1~5μM。
分子式:C50H50N2O23
分子量:1046.93
最大激发/发射波长:490/514nm(Ca2+结合)
溶解性:溶于DMSO(1~5mM)
保存:-20℃干燥避光保存,有效期一年。
结构式:
- 荧光染料均存在淬灭问题,请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。
- 乙酰氧基甲基酯(AM)易吸潮,冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂微量,开封前请将其短暂离心,以保证粉末落入管底。
- Fluo-8,AM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内,可在20~25℃温育片刻至全部融解后使用。
- Fluo-8,AM第一次使用,建议储存液现配现用,分装成单次用量,严格做到≤-20℃密封干燥冻存,以防止受潮。为了保证良好的实验效果,尽量在短时间内使用。
- 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
以下使用方法仅用作参考,可根据具体的实验条件做出调整。
一、试剂准备
- 配制Pluronic F-127母液:称取100mg Pluronic F-127粉末(货号:KM0188)中加入500μL DMSO,配制成20%(w/v)DMSO母液。溶解过程需要在40~50℃加热20~30min。溶液室温保存,不用冷藏。如有结晶析出,可以重新加热后溶解,不影响使用。
- HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer,pH7.3)或者其他生理缓冲液
二、操作步骤
- 用无水DMSO溶解Fluo-8,AM配制成1~5mM的储存液,或将已配好的Fluo-8,AM储存液取出于室温回温。(如:若配制成4mM的母液,需向50μgFluo-8,AM中加入11.9μL无水DMSO)。
- 用HHBS或其他生理缓冲液将Fluo-8,AM+DMSO储存液稀释到1~10μM的工作液,提前加入适量的20% Pluronic F-127溶液,使其终浓度为0.02%。
注①:Fluo-8,AM应用在大部分细胞的推荐加载浓度为4~5μM,具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性,建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。
注②:Fluo-8,AM工作液需现配现用,避免反复冻存。
注③:Pluronic F-127可以防止Fluo-8,AM在溶液中聚合并促使探针更好进入细胞。但Pluronic F-127可降低Fluo-8,AM的稳定性,因此只建议在配制工作液时加入,不建议加入储存液长期保存。 - (可选步骤)如果细胞内含有机阴离子转运体,丙磺舒(Probenecid,1~2.5mM)或磺吡酮(Sulfinpyrazone,0.1~0.25mM)可能需要加入细胞培养基内,以降低去酯化探针的泄露水平。
注①:丙磺舒或磺吡酮储存液相当偏碱,因此加入培养基后需要重新调整pH。 - 将准备好的Fluo-8,AM工作液加入细胞,加入量以覆盖细胞为准。37℃或者室温孵育20~60min。
注①:关于孵育的时间,如果首次做实验不能确定,建议先孵育30min,看荧光效果;如果细胞死亡较多,适当缩短时间;如果荧光强度太弱,适当延长时间。
注②:降低探针加载温度可能会降低探针的区室化现象。 - 吸掉染色工作液,并用HHBS或其他生理缓冲液(如有必要,使用含转运体抑制剂如2.5mM丙磺酸的缓冲液)替换,以去除多余探针。
- 用适当的仪器如激光共聚焦、流式细胞仪、荧光酶标仪,以及波长Ex/Em=490/520nm来进行检测。
注①:Fluo-8,AM进入胞内后,经酯酶降解形成Fluo-8,并不是以共价结合的形式滞留在细胞质内。因此不可对加载染料的活细胞进行固定处理,再进行Ca2+水平检测。
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